PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

ABSTRACT.- Moraes L.F., Takahira R.K., Golim M.A. & Baggio M.S. 2016. [Evaluation of hemostatic abnormalities and thromboembolic risk in dogs with IMHA.] Avaliação das alterações hemostáticas e do risco tromboembólico em cães com AHIM. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(5):405-411. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: liviafm@gmail.com Immune-mediated hemolytic anemia (IMHA) is the most common cause of hemolytic anemia and the most prevalent immune-mediated disease in dogs, which is classified in primary or secondary. IMHA has been associated with hypercoagulability state and thromboembolism has been referred as the most common complication. The purpose of this study was to correlate the possibility of hemostatic abnormalities and the thromboembolic risk in IMHA and in anemias of other etiologies. 76 dogs were selected, all exhibiting hematocrit lower than 20% and at least one clinical sign commonly associated with IMHA or breed predisposition. These dogs were tested for IMHA by flow cytometry. Hemostatic tests (platelet count, PT, APTT, TT, AT, PDF and D-dimer) as well as CBC, reticulocyte count, blood parasite search in peripheral blood smear, Ehrlichia sp. and leptospirosis tests were performed in all dogs. 59 dogs were positive for IMHA. The thromboembolic risk was characterized by the presence of three or more changes in the tests of the hemostatic profile. 74.6% cases of IMHA were attributed to infectious diseases and was mostly associated with Ehrlichia sp. (88.6%). 72.1% of dogs had thrombocytopenia and 57.6% had regenerative anemia with significantly higher values of metarubricyte and reticulocyte count. There were no significant changes between two anemic groups (positive and negative for IMHA). Anemic dogs had higher APTT mean value and lower AT and platelet counts mean values than the control group (p<0.05). 25 dogs with IMHA and seven dogs without IHMA had thromboembolic state. The specificity of PDF was lower (30.2%) than previous studies. The choice of the Ig class does not affect the diagnosis of IMHA. There were no correlation between the presence of antibodies bound to the RBC surface and the hemostatic tests, but there were a week correlation (p<0,05) between Ht(%) and APTT (r=-0.2621), AT (r=0.4297) and platelets count (r=0.5349) values. Anemia is associated with hemostatic abnormalities and thromboembolic risk, however the immune-mediated nature of the disease was not the determining factor for this condition. In part, these changes can be attributed to infection diseases seen in both groups (positive and negative for IMHA). The similar thromboembolic risk evidenced in both groups of anemic dogs does not exclude the relationship of immune-mediated involvement, but alert to the possibility of thromboembolism in anemic dogs with Ehrlichia sp. (negative for IHMA). Therefore, anemic dogs with clinical signs associated with thromboembolic risk should be evaluated for this complication, today poorly investigated in clinical routine. The high frequency of hemostatic abnormalities supports the importance of an early, effective and more accurate diagnosis, along with a preventive strategy and treatment.

• Anemia thrombosis hemostasia Ehrlichia sp. anemia hemolítica imuno-mediada trombose hemostasia

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Moraes L.F., Takahira R.K., Golim M.A. & Baggio M.S. 2016. [Evaluation of hemostatic abnormalities and thromboembolic risk in dogs with IMHA.] Avaliação das alterações hemostáticas e do risco tromboembólico em cães com AHIM. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(5):405-411. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: liviafm@gmail.com A anemia hemolítica imuno-mediada (AHIM) é a causa mais comum dentre as anemias hemolíticas e a doença imuno-mediada de maior prevalência em cães, incluindo causas primárias e secundárias. As AHIM tem sido associadas a estados de hipercoagulabilidade, sendo o tromboembolismo a complicação mais comum. Este estudo teve como objetivo correlacionar as possíveis alterações hemostáticas e o risco tromboembólico nas AHIM e nas anemias por outras etiologias. Para tanto, foram selecionados 76 cães anêmicos (hematócrito &#8804; 20%) somados ao menos um sinal clínico comumente associado à AHIM ou possuir pré-disposição racial. Foram realizados os seguintes testes para os animais selecionados: teste de citometria de fluxo e avaliação do perfil hemostático (contagem de plaquetas, TP, TTPA, TT, AT, PDF e Dímeros D); além de hemograma com contagem de reticulócitos, pesquisa de hematozoários em sangue periférico, PCR para Ehrlichia sp. e sorologia para leptospirose. 59 cães foram positivos para AHIM. O estado tromboembólico foi caracterizado pela presença de alteração em três ou mais testes do perfil hemostático. 74,6% casos de AHIM foram atribuídos às doenças infecciosas, sendo em sua maioria associados à Ehrlichia sp. (88,6%). 72,1% apresentaram trombocitopenia e 57,6% apresentaram anemia regenerativa com valores significativamente maiores de metarrubrícitos e contagem de reticulócitos. Não houve diferença estatística entre os grupos de cães anêmicos (positivos e negativos para AHIM). Os cães anêmicos apresentaram valores médios maiores de TTPA e menores de AT e contagem de plaquetas quando comparados aos cães saudáveis (p < 0,05). 25 cães positivos e sete negativos apresentaram estado tromboembólico. A especificidade de PDF foi menor (30,2%) quando comparada outros estudos. A escolha da classe de Ig não interfere no diagnóstico de AHIM. Não houve correlação entre a presença de anticorpos ligados às hemácias e as variáveis hemostáticas, porém houve uma fraca correlação (p<0,05) entre o hematócrito e os valores de TTPA (r=-0,2621), AT (r=0,4297) e contagem de plaquetas (r=0,5349). A anemia está associada a alterações hemostáticas e ao risco tromboembólico, no entanto a natureza imuno-mediada não é o fator determinante para esta condição. Em parte, estas alterações podem ser atribuídas ao quadro infeccioso observado em ambos os grupos (positivos e negativos para AHIM). O risco tromboembólico semelhante evidenciado nos dois grupos de cães anêmicos não exclui a relação do envolvimento imuno-mediado, mas atenta para uma possibilidade do tromboembolismo em cães anêmicos com Ehrlichia sp. (negativos para AHIM). Desta forma, cães anêmicos que apresentam sinais clínicos associados ao risco tromboembólico devem ser avaliados para tal complicação, hoje pouco investigada na rotina clínica. A alta frequência de alterações hemostáticas sustenta a importância de um diagnóstico precoce, efetivo e mais acurado, juntamente com uma estratégia de prevenção e tratamento.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Carvalho A.M., Yamada A.L.M., Martins J.R.B., Maia L., Golim M.A., Deffune E., Hussni C.A. & Alves A.L.G. 2013. Isolation and characterization of equine peripheral blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(9):1151-1154. Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Junior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: anaalves@fmvz.unesp.br The objective of the study was to isolate, cultivate and characterize equine peripheral blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells (PbMSCs). Peripheral blood was collected, followed by the isolation of mononuclear cells using density gradient reagents, and the cultivation of adherent cells. Monoclonal mouse anti-horse CD13, mouse anti-horse CD44, and mouse anti-rat CD90 antibodies were used for the immunophenotypic characterization of the surface of the PbMSCs. These cells were also cultured in specific media for adipogenic and chondrogenic differentiation. There was no expression of the CD13 marker, but CD44 and CD90 were expressed in all of the passages tested. After 14 days of cell differentiation into adipocytes, lipid droplets were observed upon Oil Red O (ORO) staining. Twenty-one days after chondrogenic differentiation, the cells were stained with Alcian Blue. Although the technique for the isolation of these cells requires improvement, the present study demonstrates the partial characterization of PbMSCs, classifying them as a promising type of progenitor cells for use in equine cell therapy.

• mesenchymal stem cells blood células tronco mesenquimais sangue periférico

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Carvalho A.M., Yamada A.L.M., Martins J.R.B., Maia L., Golim M.A., Deffune E., Hussni C.A. & Alves A.L.G. 2013. Isolation and characterization of equine peripheral blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells. [Isolamento e caracterização das células mesenquimais multipotentes estromais derivadas do sangue periférico equino.] Pesquisa Veterinária Brasileira 33(9):1151-1154. Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Junior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: anaalves@fmvz.unesp.br O objetivo deste estudo foi isolar, cultivar e caracterizar as células mesenquimais multipotentes estromais derivadas do sangue periférico (SpCTMs) equino. O sangue periférico foi coletado, seguido do isolamento das células mononucleadas utilizando o reagente de gradiente de densidade e o cultivo das células aderentes. Os anticorpos monoclonais mouse anti-horse CD13, mouse anti-horse CD44 e mouse anti-rat CD90 foram utilizados para a caracterização imunofenotípica da superfície das SpCTMs. Estas células também foram cultivadas utilizando meio de cultura específico para a diferenciação adipogênica e condrogênica. Não houve expressão do marcador CD13, mas os marcadores CD44 e CD90 foram expressos em todas as passagens testadas. Após 14 dias da diferenciação das células em adipócitos, gotículas de lipídeos foram observados através da coloração com Oil Red O. Vinte e um dias após a diferenciação condrogênica, as células foram coradas com o Alcian Blue. Embora a técnica de isolamento destas células necessite ser otimizada, o presente estudo demonstra a caracterização parcial das SpCTMs, classificando-as como um tipo de células progenitoras promissoras para o uso na terapia celular em equinos.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Maia L., Landim-Alvarenga F.C., Golim M.A., Sudano M.J., Taffarel M.O., De Vita B., Freitas N.P.P. & Amorim R.M. 2012. [Potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells from equine bone marrow.] Potencial de transdiferenciação neural das células-tronco mesenquimais da medula óssea de equino. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(5):444-452. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Júnior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: leandromvet@hotmail.com The first studies showing the potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow (BM) were conducted in camundogos and humans in the early 2000s. After this period, the number of research and publications with the same purpose increased, but with rare or scarce studies in horses. The aim of this study was to evaluate in vitro neuronal transdifferentiation potential of MSCs from equine BM using two protocols: P1 (forksolin and retinoic acid) and P2 (2-&#946;mecarptoetanol). After confirming the mesenchymal lineages, by positivity for the marker CD90 (X=97.94%), negative for the marker CD34 and positive response for osteogenic differentiation, MSCs were subjected to neural transdifferentiation (P1 and P2) for morphological analysis and expression of neural markers GFAP and &#946;3 tubulin by flow cytometry. The results revealed morphological changes in varying degrees between the tested protocols. In protocol 1, twenty four hours after incubation with the media of neural differentiation, a large proportion of cells (>80%) had similar morphology to neural cells, characterized by retraction of cellular body and a large number of cytoplasmic extension (filopodia). However, comparatively, within the first 30 minutes after exposure to the antioxidant &#946;-mercaptoethanol (P2) MSCs showed rapid morphological changes characterized mainly by retraction of cellular body and less cytoplasmic extension. It was also evidenced with the use of this protocol, lower cellular adhesion after exposure to media when compared to P1. Regarding the immunophenotyping analysis it was observed a higher (P<0.001) expression of the markers GFAP and &#946;3 tubulin at the end of P2 compared to P1. The ability of MSCs to generate cell types related to neural lineage is complex and multifactorial, depending not only of inducing agents, but also the environment in which these cells will be cultivated. Thus a greater number of studies are necessary to better understand the process of neural transdifferentiation of MSCs from equine.

• Bone marrow neural differentiation stem cells mudula óssea diferenciação neural células-tronco

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Maia L., Landim-Alvarenga F.C., Golim M.A., Sudano M.J., Taffarel M.O., De Vita B., Freitas N.P.P. & Amorim R.M. 2012. [Potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells from equine bone marrow.] Potencial de transdiferenciação neural das células-tronco mesenquimais da medula óssea de equino. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(5):444-452. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Júnior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: leandromvet@hotmail.com Os primeiros estudos demonstrando o potencial de trandiferenciação neural das células-tronco mesenquimais (CTMs) provenientes da medula óssea (MO) foram conduzidos em camundogos e humanos no início da década de 2000. Após esse período, o número de pesquisas e publicações com o mesmo propósito tem aumentado, mas com raros ou escassos estudos na espécie equina. Nesse sentindo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial in vitro da transdiferenciação neural das CTMs provenientes da MO de equinos utilizando-se dois protocolos: P1 (forksolin e ácido retinóico) e P2 (2-&#946;mecarptoetanol). Após a confirmação das linhagens mesenquimais, pela positividade para o marcador CD90 (X=97,94%), negatividade para o marcador CD34 e resposta positiva a diferenciação osteogênica, as CTMs foram submetidas a transdiferenciação neural (P1 e P2) para avaliação morfológica e expressão dos marcadores neurais GFAP e &#946;3 tubulina por citometria de fluxo. Os resultados revelaram mudanças morfológicas em graus variados entre os protocolos testados. No protocolo 1, vinte quatro horas após a incubação com o meio de diferenciação neural, grande proporção de células (>80%) apresentaram morfologia semelhante a células neurais, caracterizadas por retração do corpo celular e grande número de projeções protoplasmáticas (filopodia). Por outro lado, de forma comparativa, já nos primeiros 30 minutos após a exposição ao antioxidante &#946;-mercaptoetanol (P2) as CTMs apresentaram rápida mudança morfológica caracterizada principalmente por retração do corpo celular e menor número de projeções protoplasmáticas. Também ficou evidenciado com o uso deste protocolo, menor aderência das células após tempo de exposição ao meio de diferenciação, quando comparado ao P1. Com relação a análise imunofenotípica foi observado uma maior (P<0,001) expressão dos marcadores GFAP e &#946;3 tubulina ao término do P2 quando comparado ao P1. A habilidade das CTMs em gerar tipos celulares relacionados a linhagem neural é complexa e multifatorial, dependendo não só dos agentes indutores, mas também do ambiente no qual estas células são cultivadas. Desta forma um maior número de estudos é necessário para o melhor entendimento do processo de transdiferenciação neural a partir de CTMs de equinos.